Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Rabu/26
September 2012
Teknologi Asam Nukleat dan
Protein Waktu : 13.00 – 16.00
WIB
PJP : Dr. Suryani
Asisten : Rian Triana
Faris Fathin
Deffy Pradithya
ISOLASI
DAN PEMURNIAN DNA PLASMID
Kelompok
3
Waliyuddin G84090047
DEPARTEMEN
BIOKIMIA
FAKULTAS
MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT
PERTANIAN BOGOR
2012
Pendahuluan
Rekayasa
genetika merupakan salah satu ilmu terapan dalam merekayasa materi genetik
untuk kepentingan manusia. Obyek rekayasa genetika
mencakup hampir semua golongan organisme,
mulai dari bakteri,
fungi,
hewan
tingkat rendah, hewan tingkat tinggi, hingga tumbuh-tumbuhan.
Rekayasa genetika sudah digunakan dalam berbagai bidang
kehidupan yaitu bidang kedokteran
dan farmasi, ilmu pangan, kedokteran hewan,
pertanian (termasuk peternakan
dan perikanan), serta teknik lingkungan
juga telah melibatkan ilmu ini untuk mengembangkan bidang masing-masing. Rekayasa genetika
sendiri merupakan teknikn untuk memodifikasi DNA (sebagai
substansi kimiawi dalam kromosom yang bertanggung jawab atas pewarisan sifat) untuk menghasilkan produk-produk baru yang memiliki
kombinas sifat yang diinginkan (Chang 2009).
Teknik
yang digunakan dalam merekayasa suatu DNA adalah DNA rekombinan. DNA rekombinan adalah penyambungan molekul DNA yang satu dengan molekul DNA
yang lainnya. DNA rekombinan merupakan gabungan antara DNA vektor dan DNA asing
yang merupakan gen target. Gen yang terdapat di dalam DNA asing dimasukkan
dalam suatu DNA vektor atau biasa disebut DNA plasmid (Brown 2010).
Plasmid adalah DNA
ekstrakromosomal
yang dapat bereplikasi secara autonom dan bisa ditemukan
pada sel hidup (Royston 1972). Di dalam satu sel, dapat ditemukan lebih dari
satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua plasmid tidak
mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel tersebut (Royston 1972).
Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada
keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan kembali normal, DNA
plasmid dapat dibuang (Royston 1972).
Plasmid telah
diproduksi secara komersil oleh sejumlah perusahaan untuk digunakan sebagai vektor
kloning
(Gregory & Funnell 2004). Agar dapat digunakan
sebagai vektor kloning,
plasmid harus memiliki beberapa kriteria, yaitu berukuran kecil, relatif
memiliki jumlah salinan yang tinggi (high copy number), memiliki gen penanda seleksi
dan gen pelapor,
serta memiliki situs pemotongan enzim restriksi
untu memudahkan penyisipan DNA ke dalam vektor plasmid (Gregory
& Funnell 2004).
Keberadaan
plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik DNA rekombinan. Keberhasilan
suatu teknik DNA rekombinan tergantung dari hasil mengisolasi
dan memurnikan DNA plasmid dari bakteri atau yeast. Pemurnian DNA plasmid dilakukan untuk menghilangkan berbagai
pengotor-pengotor yang berasal dari bagian sel yaitu dinding sel dan beberapa
protein (Sambrook & Russell 2006). Pada praktikum ini DNA plasmid diisolasi
dari bakteri Escherichia coli,
sehingga dengan dilakukannya pengisolasian dan pemurnian DNA plasmid diharapkan
dapat memaksimalkan hasil DNA rekombinan dan rekayasa genetik dapat tercapai.
Tujuan
Percobaan
ini bertujuan agar Mahasiswa dapat menunjukkan sifat dan struktur DNA plasmid
melalui proses isolasi terhadap DNA plasmid.
Alat
dan Bahan
Alat-alat
yang digunakan dalam praktikum isolasi dan pemurnian DNA plasmid ini adalah
neraca analitik, gelas, sentrifus, tabung Eppendorf, dan vortex.
Bahan-bahan
yang digunakan dalam praktikum ini adalah Tris-HCl 25 Mm pH 7,5, sukrosa 15 %,
SDS 1 %, fenol, etanol absolut, dH2O steril, tripton, ampicilin,
EDTA 10 mM, NaOH 0,2 M, Na asetat 3 M pH 4,6, kloroform, etanol 70 %, ekstrak
khamir, dan NaCl.
Prosedur
Percobaan
`Pembuatan larutan. Ada
3 jenis larutan yang dibuat untuk mengisolasi dan memurnikan DNA plasmid
bakteri Escherichia coli. Larutan
pertama dibuat dari Tris-HCl 25 mM pH 7.5 yang berfungsi sebagai bufer, EDTA 10
mM sebagai pengkelat logam, dan larutan sukrosa 15% yang berfungsi untuk
memecahkan dinding sel bakteri. Larutan 2 dibuat dari larutan NaOH 0.2 M yang
berfungsi untuk mengendapkan dinding sel dan larutan SDS 1% yang berfungsi
sebagai emulgator. Larutan 3 dibuat dari Na-asetat 3 M ber-pH 4.8 yang berfungsi sebagai
bufer, larutan fenol/kloroform, etanol absolut, etanol 70% untuk mengendapkan
protein, dan dH2O steril yang berfungsi untuk melarutkan DNA
plasmid.
Pembuatan media LB.
Sebanyak 0,5
g ekstrak khamir, 1
g tripton, 0.5 g NaCl dicampur dan diaduk rata, kemudian disterilisasi dengan
autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit. Setelah itu, ditambahkan ampicilin dengan
konsentrasi akhir 50
µg/ml yang dilarutkan dalam
akuades. Kemudian, volumenya ditera sampai dengan 200 ml.
Isolasi dan pemurnia DNA plasmid. 1.5 ml kultur bakteri
yang telah dibiakkan dalam medium LB dituangkan dalam tabung Eppendorf.
Kemudian, tabung disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 3 menit.
Supernatan yang dihasilkan dibuang dan pelet yang dihasilkan ditambahkan 100 µl
larutan 1. Kemudian tabung divorteks untuk mensuspensikan pelet dan tabung
disimpan di atas es selama 5 menit. Lalu tabung ditambahkan 200 µl larutan 2
dan dicampurkan dengan cara tabung dibolak-balik secara perlahan serta tabung
disimpan dalam es selama 5 menit. Setelah 5 menit tabung ditambahkan kembali
dengan 150 µl larutan 3 dan dicampurkan dengan cara dibolak-balik secara
perlahan. Kemudian, tabung disimpan dalam es selama 5 menit. Setelah 5 menit, tabung disentrifus
selama 10 menit dengan kecepatan 8000 rpm pada suhu 4°C dan supernatan yang
dihasilkan dipindahkan ke dalam tabung Ependorf yang baru. Tabung yang berisi
supernatan ditambahkan 300 µl larutan fenol/kloroform dan tabung divorteks
selama 5 menit. Lapisan atas yang terbentuk dipisahkan secara hati-hati dan
dimasukkan ke dalam tabung Ependorf yang baru. Kemudian ditambahkan 1 mL etanol
absolut dan divorteks, setelah
itu didiamkan selama 5 menit pada suhu ruang. Tabung disentrifus kembali selama
15 menit dengan kecepatan 12000 rpm. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan
pelet yang dihasilkan ditambah dengan 1 mL etanol 70%. Tabung divorteks selama
1 menit dan disentrifus kembali dengan kecepatan 12000 rpm selama 5 menit.
Supernatan dihilangkan kembali dan dikeringkan pelet yang dihasilkan dengan
vakum. Kemudian,
pelet disuspensikan kembali dengan 20-50 µl dH2O
Hasil
Percobaan
Pembahasan
Secara
garis besar prinsip yang digunakan dalam mengisolasi DNA plasmid adalah sama
dengan isolasi DNA/RNA dari suatu sel. Prinsip yang digunakan adalah melakukan
isolasi plasmid dengan
sentrifugasi dan presipitasi. Hal ini
dilakukan dengan memecah dan mengekstraksi
jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel
jaringan, DNA, dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasi sehingga dihasilkan
pelet sel yang mengandung plasmid
(Blackwell 1997).
Langkah
pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah menumbuhkan sel-sel bakteri (house) dalam sebuah media. Bakteri yang
digunakan adalah Escherichia coli DH5alfa
sedangkan media yang digunakan adalah media LB. Bakteri Escherichia
coli digunakan karena bakteri ini mudah didapatkan. Selain itu, Escherichia coli dapat menghasilkan
keturunan yang banyak dalam waktu singkat. Bakteri ini juga memiliki jumlah
plasmid yang banyak.
Biakan
yang diperoleh dalam praktikum isolasi dan pemurnian DNA plasmid ini berjumlah
75 ml. Biakan Escherichia coli
ini mengandung plasmid yang sudah disisipi gen plantaricin (sejenis ampisilin)
dari Lactobacillus sp. Nama plasmid yang
digunakan adalah plasmid pGem-T easy vektor. Biakan yang sudah
mengandung DNA rekombinan berupa suatu gen yang menyandi ampisilin tersebut
akan tetap hidup dalam media LB yang sudah ditambah ampisilin, sedangkan biakan
yang tidak mengandung gen ampisilin maka akan mati. Ampisilin merupakan suatu
senyawa antibiotik yang bersifat toksik. Biakan akan mati karena ketoksikan
ampisilin jika dalam DNA-nya tidak mengandung suatu gen untuk mendegradasi
ampisilin. Fungsi ini membuat ampisilin sering digunakan untuk menyeleksi DNA
plasmid karena ampisilin dapat bersifat selektif (Royston
1972).
Isolasi DNA plasmid
dapat dilakukan dengan menggunakan prosedur sebagai berikut, yaitu: isolasi
sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan
presipitasi. Isolasi sel dilakukan dengan cara sentrifugasi pada 8000 rpm
selama 15 menit, kemudian terbentuk supernatan dan pelet. Sel dari bakteri Escherichia
coli akan berada pada
pelet sehingga supernatan harus dibuang. Prinsip
utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul
dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat
akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di
atas.
Setelah
itu, ditambahkan Larutan 1 yang terdiri atas Tris-HCl 25 mM, EDTA 10 mM, dan
sukrosa 15%. Larutan 1 ini berfungsi untuk memecah dinding sel dan
mensuspensikan pellet sampai larut. EDTA dapat menghambat DNAse yang dapat
mendenaturasi DNA sebagai pengkelat Mg2+ yang berperan merusak
stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil. Selain
itu, Tris-HCl juga berfungsi untuk menjaga pH larutan.
Tahap
selanjutnya adalah menambahkan
Larutan 2 ke dalam campuran larutan. Larutan 2 terdiri atas NaOH 0.2 M dan SDS
1%. Larutan 2 digunakan untuk mengendapkan dinding sel bakteri. SDS dalam
larutan ini berfungsi untuk menghancurkan membran sel dan mendenaturasi
protein, sedangkan NaOH berfungsi untuk mendenaturasi DNA genomik dan mulai
menghidrolisis RNA. Metode dalam tahap
ini memiliki perbedaan dengan isolasi pada DNA kromosom. Pada isolasi DNA
kromosom tidak ditambahkan NaOH karena jika ditambahkan maka NaOH akan
mendenaturasi DNA dan menghidrolisis RNA yang kita inginkan, sehingga pada
isolasi DNA kromosom tidak ditambahkan NaOH (Chang 2009).
Langkah berikutnya adalah
menambahkan larutan 3 ke dalam campuran larutan. Larutan 3 berisi Na-asetat 3M,
larutan fenol-kloroform, etanol absolut,
etanol 70%, dan dH2O. Na-asetat dengan pH 4.8 akan mengakibatkan terjadinya
renaturasi plasmid dan mengendapnya single
strand DNA karena molekulnya yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan
kadar garam yang tinggi. Selain itu, adanya pembentukan KDS (kalium
dodesisulfat) yang tidak larut menyebabkan SDS mudah terbuang. Penambahan
Larutan 3 juga berfungsi untuk mempertahankan pH agar DNA plasmid tidak rusak.
Sentrifugasi kembali dilakukan setelah penambahan
ketiga larutan di atas sehingga diperoleh sedikit pelet dan supernatan. Supernatan yang diperoleh tidak
berwarna, menunjukkan bahwa brismolekul sudah terendapkan dengan sempurna
sehingga tidak mencemari supernatan. Supernatan dipindahkan, dan ditambahkan
dengan fenol/kloroform. Fenol/kloroform berfungsi untuk menghilangkan protein dan pengotor-pengotor
lain dalam larutan. Fenol/kloroform akan mengikat, menarik, dan mempresipitasi
protein sehingga fase air yang terpisah akan mengandung DNA (Sambrook & Russell 2006). Setelah disentrifus, terlihat
akibat dari penambahan fenol/kloroform, yaitu DNA plasmid berada pada lapisan atas.
Metode lain yang biasa digunakan dalam deproteinase
selain menggunakan fenol-klorofrom adalah metode pengikatan dengan silika.
Prinsip kerja dari metode ekstraksi DNA dengan silika adalah menyerap DNA
dengan menggunakan silika dan garam chaotropik. Garam chaotropik berfungsi
untuk merusak jaringan ikatan hidrogen dalam air dan protein sehingga membuat
protein-protein yang merupakan kotoran-kotoran pada DNA denaturasi atau lisis.
Pada larutan asam (pH < 7,5), DNA akan diserap oleh silika , sedangkan pada
pH basa dan konsentrasi garam rendah, DNA secara efisien adakn dipisahkan dari
silika (Gregory & Funnell 2004).
Etanol absolut ditambahkan pada
lapisan
paling atas yang berisi DNA plasmid. Penambahan etanol absolut bertujuan untuk
mengendapkan plasmid karena adanya perbedaan polaritas. Penambahan etanol absolut harus dilakukan pada keadaan
dingin dengan tujuan agar banyak DNA plasmid yang mengendap. Prinsip pengendapan dengan menggunakan etanol absolut dingin,
yaitu pada saat penambahan garam yaitu Na-asetat yang berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA,
maka ion-ion seperti kation Na+ akan menyelimuti rantai DNAyang bermuatan negatif. Jika di
dalam air, gaya elektrostatik antara ion positif (Na+) dan negative (DNA) masih lemah karena
sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air. Air memiliki konstanta
dielektrik yang tinggi, sehingga penambahan pelarut organik seperti etanol
dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau memperbanyak ikatan DNA
dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah terpresipitasi (Brown 2010).
Langkah selanjutnya adalah
melakukan sentrifugasi kembali dan diperoleh pelet dalam jumlah yang sangat sedikit.
Supernatan dibuang dan dilakukan penambahan etanol 70% pada pelet. Tujuan
penambahan etanol yaitu untuk membersihkan sisa-sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid sebelumnya
sehingga diperoleh plasmid yang murni. Proses terkahir yaitu penambahan dH2O
sampai DNA plasmid yang mengendap itu bercampur (Brown 2010).
Simpulan
DNA
plasmid pGEM-T DH5alfa merupakan salah satu DNA sirkular utas ganda yang
berukuran kecil. DNA plasmid pGEM-T DH5alfa membawa satu gen pembawa sifat
resisten terhadap antibiotika yaitu plantaricin. DNA plasmid pGEM-T
DH5alfa juga dapat bereplikasi walaupun
berada di luar sel kromosom.
Daftar
Pustaka
Brown Terry A. 2010. Gene Cloning and DNA Analysis:
An Introduction. Wiley-Blackwell. ISBN 978-1-4051-8173-0. Hal. 35-36.
Chang W. 2009. Bioetika sebuah pengantar. Yogyakarta: Kanisius.
Gregory Phillips G, Funnell BE. 2004. Plasmid
biology. Washington: ASM Press. ISBN 978-1-55581-265-2.Hal.1-6.
Royston C Clowes. 1972. Molecular Structure of
Bacterial Plasmids. Bacteriological Reviews 36 (3): 361-405.
Sambrook, Russell. 2006. The Condensed Protocols From Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbour Laboratory
Press.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar