Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Rabu/10
Oktober 2012
Teknologi Asam Nukleat dan
Protein Waktu : 13.00 – 16.00
WIB
PJP : Dr. Suryani
Asisten : Rian Triana
Faris Fathin
Deffy Pradithya
ISOLASI
DAN PEMURNIAN DNA KROMOSOM
Kelompok
3
Waliyuddin
G84090047
DEPARTEMEN
BIOKIMIA
FAKULTAS
MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT
PERTANIAN BOGOR
2012
Pendahuluan
DNA merupakan tempat penyimpanan informasi genetik. DNA
merupakan molekul yang sangat
panjang, terdiri dari ribuan deoksiribonukleotida yang bergabung dalam suatu
urutan yang bersifat khas bagi tiap organis. DNA bertanggung jawab
atas pewarisan informasi genetik dari suatu generasi ke generasi berikutnya.
DNA juga merupakan bahan organik yang memiliki BM (berat molekul) paling besar
dalam sel, yaitu dalam ukuran juta. Monomer DNA adalah nukleotida. Satu gen
diatur oleh satu molekul DNA, dan satu molekul DNA diatur oleh ribuan sampai
puluhan ribu nukleotida (Lehninger 1982).
DNA berfungsi sebagai pengatur perkembangan
biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA hanya terdapat pada inti
sel, mitokondria, dan kloroplas. DNA juga merupakan serangkaian molekul tersusun
dari basa purin (adenin dan guanin) dan pirimidin (timin dan sitosin) serta
gula dan fosfat sebagai bahan dasar penyusun gen (Klug dan Cummings 1994).
Isolasi
DNA kromosom banyak digunakan dalam penelitian mengenai konstruksi DNA genomik
sebagai sumber klon dan sebagai bahan untuk amplifikasi DNA serta analisis restriksi berbagai
spesies tanaman. Prinsip isolasi DNA kromosom itu sendiri didasarkan pada
pemisahan DNA kromosom dari pengotor lain berupa protein atau RNA menggunakan teknik sentrifugasi.
Secara umum isolasi DNA kromosom terbagi atas tiga tahapan proses yaitu pemecahan
sel atau pelisisan sel, menghilangan komponen lain selain DNA kromosom, dan
pemekatan larutan DNA yang diperoleh (David et
al. 1983).
Isolasi DNA
kromosom merupakan tahap yang paling penting yang harus dilakukan. Hal ini
dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang umumnya kita kehendaki untuk
diklon yang harus bersih dari pengotor-pengotor seperti protein
dan RNA. Prinsip
dari proses isolasi DNA kromosom adalah memisahkan DNA kromosom dari
komponen-komponen sel lain.
Sumber DNA dapat berasal dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel
manusia. Membran sel dilisis dengan menambahkan detergen untuk membebaskan
isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease (yang berfungsi
mendegradasi protein) dan
RNase (yang berfungsi untuk mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah
DNA. Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 60°C untuk menginaktifasi enzim yang mendegradasi
DNA (DNase). Larutan DNA kemudian dipresipitasi dengan etanol dan bisa
dilarutkan lagi dengan air (Brush 1994).
Tujuan
Percobaan
ini bertujuan agar mahasiswa dapat menunjukkan sifat dan struktur DNA kromosom
melalui proses isolasi terhadap DNA kromosom.
Alat
dan Bahan
Alat
yang digunakan dalam praktikum isolasi dan pemurnian DNA kromosom, yaitu:
neraca analitik, gelas, sentrifus, tabung Eppendorf, dan vortex. Bahan yang
digunakan dalam praktikum, yaitu: umbi bawang merah, larutan lisis yang berisi Tris-HCl
50 mM pH 8.0 yang mengandung 50 mM EDTA,
SDS 10%, buffer
elusi/buffer TE yang berisi Tris-HCl
10 mM pH 8.0 yang mengandung 0,1 mM EDTA pH 8,0, EtOH,
NaCl, dan
dH2O steril.
Prosedur
Percobaan
Pembuatan larutan. Larutan lisis
terdiri dari 50 mM Tris HCl, pH 8,0 yang mengandung 50 mM EDTA. Sedangkan
larutan elusi atau buffer TE dibuat dari 10 mM Tris-HCl pH 8,0 yang mengandung
0.1 mM EDTA pH 8.0. Setelah itu, larutan disimpan di pendingin.
Prosedur isolasi DNA kromosom. Sebanyak 25 gram umbi
bawang digerus dengan menggunakan mortar, ditambahkan 40 mL larutan lisis dan
2,5 gram garam dapur digerus sampai halus. Setelah itu, dituang ke dalam gelas
piala 250 mL dan ditambahkan 5 mL larutan SDS 10%. Larutan
dicampur secara homogen dan diinkubasi pada suhu 60°C dalam water bath selama 20 menit. Hasil
inkubasi lalu disaring ke dalam gelas beaker yang ditempatkan diatas es
sehingga larutan tersebut segera menjadi dingin. Setelah larutan menjadi dingin
kemudian ditambahkan 0,5 gram protease, aduk secara sempurna dan biarkan selama
15 menit. Kemudian larutan dibiarkan 5 menit lalu diambil larutan atas dengan
menggunakan pipet tetes dan dipindahkan ke dalam 4 tabung baru. EtOH dingin
sebanyak 10 mL ditambahkan melalui sisi tabung. Kemudian, tabung
ditempatkan secara perlahan di atas es dan dibiarkan selama 2-5 menit. DNA
kromosom akan mengendap pada bagian atas dari EtOH dan tampak sebagai
benang-benang putih. DNA kromosom diambil dengan pipet tetes secara hati-hati
dengan sesedikit mungkin larutan EtOH yang terambil dan ditempatkan pada 2
tabung eppendorf 1.5 mL. Keempat tabung
disentrifugasi selama 1 menit. EtOH dibuang pada lapisan atas secara hati-hati
tanpa merusak pellet dan ditambahkan 1 mL EtOH ke pellet DNA kromosom. Resuspen
pelet DNA kromosom dengan cara vortex dalam 1 mL EtOH dan disentrifugasi
kembali selama 1 menit. EtOH dituang dan DNA kromosom dikeringkan dalam bech selama 10 menit. Setelah kering,
buffer TE atau dH2O steril 1 mL untuk melarutkan DNA kromosom.
Hasil Percobaan
Tris-HCl 50 mM pH 8.0, BM = 121.14 g/mol
g = M . V . BM
= 0.050 M . 0.500 L . 121.14 g/mol
= 3.0285 g
EDTA 50 mM, BM =
292.25 g/mol
g = M . V . BM
= 0.050 M . 0.500 L . 292.25 g/mol
= 7.7063 g
Tris-HCl 10 mM, BM
= 121.14 g/mol
g = M . V . BM
= 0.010 M . 0.010 L . 121.14 g/mol
= 0.0121 g
EDTA 0,1 mM, BM = 292.25
g/mol
g = M . V . BM
= 0.00010 M . 0.010 L .
292.25 g/mol
= 0.000292 g
Pembahasan
Isolasi
DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang
merah pada praktikum kali ini. Penggunaan
umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian DNA kromosom disebabkan umbi
bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat akan lebih jelas dan
mudah diisolasi. Beberapa pereaksi digunakan dalam proses
isolasi DNA kromosom dari umbi bawang merah, diantaranya
garam untuk melarutkan DNA, larutan lisis yang berfungsi melisis dinding sel,
SDS 10% berfungsi untuk memecahkan dinding sel dengan mengemulsi lipid dan
protein merusak interaksi polar pada membran sel, penambahan alkohol dingin
berfungsi untuk mengikat DNA dan membentuk suatu matriks kental seperti lem
putih akibat pemekatan DNA, dan larutan buffer TE atau dH2O untuk
merutkan DNA kromosom.
Garam
yang digunakan adalah garam NaCl. NaCl dapat menyebabkan menyebabkan
DNA menjadi larut karena
ion Na+ mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif
fosfat DNA yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak
menolak satu sama lain sehingga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan
kutub negatif fosfat DNA. Hal ini akan
menyebabkan DNA akan terkumpul (Doyle & Doyle 1990).
Penambahan alkohol dingin pada ekstrak ekstrak
sel melalui dinding tabung
akan membentuk gumpalan putih.
Etanol dingin berfungsi dalam pengikatan strand DNA yang telah terkumpul kerena
pemekatan oleh garam. Hal ini karena
kerapatan alkohol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka alkohol akan
berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. Strand-strand DNA yang
terikat oleh alkohol akan nampak sebagi benang-benang putih yang terapung di
atas filtrat.
Benang-benang
DNA berwarna putih pada lapisan atas larutan diambil
dan dimasukkan dalam tabung eppendorf 1.5 ml untuk selanjutnya disentrifugasi
dengan kecepatan 13.000 rpm. Sentrifugasi
berfungsi untuk memisahkan DNA kromosom dari
komponen lain seperti protein ataupun RNA. Pemisahan
dengan sentrifus didasarkan perbedaan bobot molekul. DNA kromosom yang
memiliki bobot molekul lebih besar akan
berada dibagian dasar setelah disentrifugasi. Pada tahap akhir pelet dikering-anginkan
untuk menghilangkan EtOH dan DNA kromosom yang didapatkan ditambahkan dengan dH2O
steril.
Metode lain yang sering digunakan untuk isolasi
DNA kromosom diantaranya adalah
metode CTAB (Sambrook et al. 1989).
Pada metode ini dilakukan pembuatan larutan bufer lisis (0.2M Tris-HCl pH 7.5,
0005M EDTA pH 8, 2M NaCl, dan 2% CTAB) dan bufer ekstraksi (0.35 M sorbitol,
Tris-Cl pH 7.5, 5 mM EDTA, dan dH2O). Sumber DNA kromosom dihaluskan
dengan bantuan nitrogen cair, setelah itu ditambahkan bufer isolasi DNA
(campuran bufer lisis, bufer ekstraksi, dan sarcocyl). Suspensi divorteks dan
diinkubasi selama satu jam pada suhu 65oC. Setelah satu jam
ditambahkan 750 µl
kloroform-isoamil alkohol (24:1) dan disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm
selama 5 menit pada suhu 4oC, kemudian lapisan atas diambil dan
dipindahkan ke dalam tube eppendorf lain dan ditambahkan larutan isopropanol.
Sentrifus kembali selama 5 menit dengan kecepatan dan suhu yang sama dan
supernatant yang dihasilkan dibuang. Pelet yang dihasilkan dicuci dengan
menambahkan 500 µl EtOH 70%, kemudian disentrifus kembali dengan kecepatan yang
sama selama 3 menit dan supernatant dibuang. Sentrifus kembali selama 1 menit
dengan kecepatan yang sama, pelet yang dihasilkan dikeringkan dan dilarutkan
dengan 50 µl TE dan disimpan pada suhu 20oC.
Metode Castillo et al. (1994) digunakan dalam isolasi
DNA kromosom. Pada metode ini hal yang dilakukan pertama kali adalah dengan
menimbang 1 gram sumber DNA kromosom. Kemudian direndam dalam larutan N2
cair dan sampel digerus sampai halus dan 0.1 gram PVPP ditambahkan saat sampel
digerus. Serbuk halus yang dihasilkan dimasukkan dalam tabung sentrifus yang
berisi 5 ml bufer ekstraksi dan 1% merkaptoetanol 50 µl yang sudah dipanaskan.
Campuran tersebut dikocok kemudian dipanaskan selama 30 menit pada suhu 65°C
sambil sesekali dikocok agar tidak mengendap lalu didinginkan pada suhu kamar.
Larutan CI ditambahkan sebanyak 1 volume ke dalam masing-masing tabung dan
bobotnya diseimbangkan sebelum sentrifugasi.
Campuran
divorteks sampai homogen lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13500 g selama 10
menit pada suhu 4°C. Sebanyak 4 ml supernatan yang diperoleh dipindahkan ke
tabung sentrifus baru dan ditambah larutan CI 1 volume. Campuran ini kemudian
divorteks sampai homogen dan disentrifugasi seperti yang dilakukan sebelumnya.
Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung baru sebanyak 3 ml dan ditambah
larutan CI 1 volume. Campuran kemudian dihomogenasi dengan vorteks dan disentrifugasi
seperti sebelumnya. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung sentrifus
baru sebanyak 1 ml dan ditambah isopropanol dingin 1 volume. Larutan dikocok
perlahan kemudian disimpan dalam lemari es selama 30 menit. Larutan kemudian
disentrifugasi kembali seperti sebelumnya dan supernatan yang diperoleh
dibuang. Pelet yang dihasilkan kemudian dikeringkan.
Pelet DNA yang
dihasilkan dilarutkan dalam 1 ml bufer TE, setelah itu ditambah 3 M CH3COONa
dingin pH 5.2 sebanyak 1/10 volume (100 μl) dan 2.5 ml etanol absolut dingin
secara berurutan. Kemudian disimpan dalam pendingin -20°C selama 30 menit atau
semalaman. Suspensi disentrifugasi kembali dengan kecepatan 16000 g selama 10
menit pada suhu 4°C. Supernatannya dibuang dan pelet DNA yang diperoleh dicuci
dengan etanol dingin 70% sebanyak 400 μl kemudian diendapkan dengan
sentrifugasi kembali dengan kecepatan 16000 g selama 5 menit pada suhu 4°C.
Pelet yang diperoleh dikeringkan dengan membalikkan tabung di atas tisu dan
diangin-anginkan sebentar hingga bau etanol hilang. Pelet DNA dilarutkan dengan
MW 100 μl. Jika pelet yang dihasilkan cukup banyak maka MW bisa ditambahkan
lebih banyak. Setelah semua pelet DNA larut kemudian dipindahkan dalam tabung
Eppendorf kecil dan disimpan dalam pendingin sebagai DNA stok.
Metode
SDS (Zheng et al 1995), isolasi DNA
kromosom dengan metode ini yang dilakukan pertama kali yaitu pembuatan bufer
pengekstrak (25 mM EDTA pH 7.5,
50 mM TrisHCl pH 8, 300 mM NaCl, SDS 1%,
dan H2O). Sumber DNA kromosom dihaluskan dengan ditambahkan 400 ul
buffer pengekstrak, kemudian setelah halus ditambahkan 100 ul buffer
pengekstrak kembali. Setelah itu
diambil 400 ul larutan dan ditambah dengan 400 ul chloroform. Suspensi divortex
dan setelah homogen larutan disentrifus dengan kecepatan 13000 rpm selama 1
menit pada suhu 40C. Lapisan atas diambil dan dimasukkan ke dalam
tube eppendorf, kemudian ditambahkan 800 µl Etanol absolut. Larutan
disentrifugasi selama 3 menit dengan
kecepatan 13.000 rpm pada suhu 40C, kemudian supernatan dibuang.
Pelet dicuci kembali dengan menggunakan 500 µl EtOH 70 %. Supernatan dibuang,
kemudian endapan dicuci kembali dengan etanol 70% dan disentrifugasi 13000 rpm
pada suhu 40C. Supernatan dibuang kembali, dan pelet dikeringkan
dengan menggunakan vakum. Setelah
kering, pelet ditambah dengan 50 ul TE dan DNA disimpan pada suhu 200C.
Simpulan
Proses isolasi DNA kromosom
pada umbi bawang merah memiliki empat tahap,
yaitu: pemecahan sel, pengendapan DNA, penghilangan komponen lain selain DNA,
dan pemekatan DNA. DNA kromosom memiliki bobot molekul yang
besar dibandingkan molekul dalam sel lainnya. DNA kromosom tidak tahan panas
dan DNA kromosom memiliki struktur double
helix.
Daftar
Pustaka
Brush A. 1994. Biologi
Molekular Sel Edisi ke-2. Jakarta: Gramedia.
Castillo OC,
Chalmers KJ, Waugh R, Powell W. 1994. Detection
of genetic diversity and selective gene in coffee using RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 87, 332-339.
David AM, Freyer
GA, Crotty DA. 1983. DNA Science: A First
Course. New York: Laboratory Press.
Doyle J.J and
Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA
from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1):13-15.
Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 3. Maggy Thenawijaya, penerjemah.
Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles
of Biochemistry.
Marks DB, Marks
AD, Smith CM. 1996. Biokimia Kedokteran
Dasar: Sebuah Pendekatan Klinis. Jakarta: EGC.
Sambrook J,
Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular
Cloning : A laboratory Manual, 2nd Edition. USA: Cold Spring Harbor Laboratory
Press.
Zheng K, Huang N, Bennet P. and Khush GS. 1995. PCR-Based Marker Assisted Selection
In Rice Breeding. IRRI news lett 2.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar